Y despues de tanto trabajo, a verificar:

Despues de purificar los plásmidos hay que verificar si el resultado es el esperado.

Para eso corrimos en un gel de agarosa pequeñas cantidades de lo que obtuvimos, en su estado normal, y abiertos con una enzima de restricción para correr los plásmidos en su forma lineal y compararlo con los marcadores de peso molecular:

En la calle 1: Plasmido con IL-12 purificado por Ezequiel (8.8 Kb)
En la calle 2: Plasmido sin IL-12 de prueba (4.8 Kb)
En la calle 3: Plasmido purificado por Ezequiel cortado con la enzima Hind III (8.8 Kb)
En la calle 4: Plasmido sin IL-12 de prueba cortado con la enzima Hind III (4.8 Kb)
En la calle 5: Marcadores de Peso Molecular (lader: 0.5-1-1.5-2-3-4-5-6-8-10 Kb)
En la calle 6: Plasmido con IL-12 purificado por Sebastián cortado en enzima Hind III (8.8 Kb)
En la calle 7: PLasmido con IL-12 purificado por Sebastián en una concentración más diluida cortado con enzima Hind III (8.8 Kb)
En la calle 8: Plasmido con IL-12 purificado por Sebastián (8.8 Kb)

Todo esto sumergido en una solución de buffer TBE con bromuro de Etidio en una cuba de electroforesis:

Luego de 2 horas corriendo con un voltaje de 70V.


En base a esto reconocimos que el plasmido fue purificado con éxito. Además, debido a las "sonrisas" observadas sabemos que la concentración obtenida también es bastante grande.

Pero pasa saber bien la concentración y cantidad de plasmidos es necesario usar el espectofotómetro:



Para eso se mide la Absorbancia a 260 nm (para ver concentración de ADN) y a 280 nm (para ver concentración de proteinas) y se realiza la relación Abs 260/Abs 280 para definir la pureza (tiene que dar entre 1.8 y 2)

Plasmido Ezequiel:
Abs 260=0.9243 Abs 280=0.4695 Abs260/Abs280= 1.9688 (todo esto diluido 1/60)
Plasmido de prueba (sin IL-12):
Abs 260=0.3742 Abs 280=0.1008 Abs260/Abs280=3.7126
Plasmido Sebastián:
Abs 260=2.4515 Abs 280=1.2578 Abs260/Abs280=1.9490 (dilucion 1/40)
Abs 260=1.1174 Abs 280=0.5377 Abs260/Abs280=2.0762 (dilución 1/80)
Abs 260=0.5091 Abs 280=0.2330 Abs260/Abs280=2.1852 (dulucion 1/160)

Blanco usado: TRIS

Resultados:

Concentración
Plasmido Ezequiel: 2,7729 microgramos/mililitros
Plasmido de Pruba (sin IL-12): 1,3097 microgramos/mililitros
Plasmido Sebastián: 4,0728 microgramos/mililitro

Masa de ADN: (concentración x volumen)
Plasmido Ezequiel: 415,935 microgramos (En 150 ml)
Plasmido de prueba (sin IL-12): 196,455 microgramos (En 150 ml)
Plasmido Sebastián: 407,28 microgramos (En 100 ml)