Protocolo de purificacion de ADN utilizando un kit de plasmidos QIAGEN
Procedimiento:
1) Selecciona una sola colonia de una plaqueta selctiva recientemente sembrada por estrias e inocula un cultivo iniciador de entre 2 y 5 ml con medio eleve conteniendo el antibiotico selectivo apropiado, incubar por 8 horas a 37 grados con agitación vigorosa(equivalente a 300 rpm).
Usar un tubo o frasco con volumen de al menos 4 veces el volumen del cultivo.
2) Diluir el cultivo inicial entre 1\ 500 y 1\1000 con el medio eleve selctivo para plasmidos con copia alta inocular 25ml o 100ml del medio, para plamsidos con copia baja inocular 100 mlo 500ml de medio, cultivar a 37 grados c por 12-16 horas con agitación vigorosa (equivalente a 300 rpm).
Utiliza un frasco o recipiente con un volumen de al menos veces el volumen del cultivo. El cultivo debería llegar a una densidad celular de aproximadamente 3-4 x10 a la 9 celulas por mililitro que típicamente corresponde a un peso de pellet húmedo de aproximadamente 3 gr\litro de medio.
3) Cultivar las células bacteriales por centrifugación a 6000xg por 15 minutos a 4 grados c.
6000xg corresponde a 6000 rpm en Rotores Sorvall GSA o GS3 o Beckman JA-10. Remover todas las huellas de sobrenadante invirtiendo el tubo de centrifuga abierto hasta que todo el medio haya sido drenado.
• Si deseas detener el protocolo y continuar después congelar los pellet de células a -20 grados c
4) Resuspender el pellet de bacteria en 4 o 10 ml de buffer P1.
Para que la lysis sea eficiente es importante usar un recipiente que sea lo suficientemente grande como para permitir mezclar completamente los buffers de lysis. Asegurarse de que la ARNasa haya sido aniadida al buffer P1. Las bacterias deberían ser suspendidas completamente vortexeando o pipeteando para arriba y para abajo hasta que no queden aglomeraciones de células.
5) Aniadir 4 o 10 ml de buffer P2, mezclar suave pero completamente invirtiendo de 4 a 5 veces el recipiente, e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
No vortexear, porque esto resultaría en que el ADN genómico se parta en varios pedazos. El lysato debería parecer viscoso. No permitir que la reacción de lysis proceda por mas 5 minutos. Después del uso, la botella conteniendo buffer P2 deberia ser cerrada inmediatamente para evitar acidificación por el CO2 en el aire.
6) Aniadir 4 o 10 ml de buffer P3 enfriado, mezclar inmediata pero suavemente invirtiendo el recipiente de 4 a 6 veces, e incubar en hielo por 15 a 20 minutos.
La precipitación es reforzada usando buffer P3 enfriado e incubando en hielo. Después de la adision del buffer P3, un material blanco y esponjoso se formara y el lysato se hara menos viscoso. El material precipitado contiene ADN, proteínas, residuos celulares y SDS. El lysato debería ser bien mezclado para asegurar la precipitación incluso de dodesil sulfato de postasio. Si la mezcla sigue pareciendo viscosa y de un ligero color marron será necesario mezclar mas para neutralizar completamente la solución.
7) Centrifugar a 20000xg o mas por 30 minutos a 4 grados c. Remover el sobrenadante conteniendo ADN plasmidico con rapidez.
Antes de cargar la centrifuga, la muestra deberia ser mezclada nuevamente. La centrfugacion debería realizasre en un tubo que no sea de vidrio. Una fuerza centrifuga de 20000xg corresponde a 12000 RPM en un Rotor Beckman JA-17 o 13000 RPM en un Rotor Sorvall SS-34. Luego de la centrifugación el sobrenadante debería ser transparente.
Nota: en vez de los pasos 7 y 8 de centrifugación, el lysato puede ser eficientemente eliminado por filtración usando un cartucho de filtro QIA.
8) Centrifugar el sobrenadante nuevamente a 20000xg o mas por 15 minutos a 4 grados c. Remover el sobrenadante conteniendo ADN plasmidico con rapidez.
Este segundo paso de centrifugación debería ser llevado a cabo para evitar la aplicación de material suspendido o particulado a la columna QIAGEN. El material suspendido (que causa que la muestra parezca turbia) pueda tapar la columna QIAGEN y reducir o eliminarla corriente por gravedad.
• Remover una muestra de 240 o 120 microlitros de muestra del sobrenadante libre de lysato y conservar para un gel analítico para determinar si las condiciones de crecimiento y lysis fueron optimas.
9) Equilabrar la columna QIAGEN 100 o 500 aplicando o 10 ml de buffer QBT, y permitir que la columna se vacie por gravedad.
La corriente de buffer comenzara automaticamente con una reducción en la tensión superficial por la presencia de detergente en el buffer de equilibrio. Permitir que la columna QIAGEN se drene completamente. Las columnas QIAGEn pueden ser dejadas sin supervisión porque la corrida del buffer se detendrá cuando el menisco llegue a la frita superior de la columna.
10) Aplicar el sobrenadante del paso 8 a la columna QIAGEN y permitir que entren a la resina por gravedad.
El sobrenadante debería ser cargado a la columna QIAGEN rapidamente, si se deja demasiado tiempo se vuelve turbio por la precipitación de proteinas y debe ser centrifugado de nuevo o filtrada para prevenir que se tape la columna QIAGEN.
• Remover una muestra de 240 o 120 microlitros de lo que fluyo y conservar para un gel analítico para determinar la eficiencia de retención de ADN de la resina QIAGEN.
11) Lavar la columna QIAGEN con 2x10ml o 2x30ml de buffer QC.
Permitir que el buffer QC fluya a través de la columna QIAGEN por gravedad. El primer lavado es suficiente para remover todos los contaminantes en la mayoria de las preparaciónes de ADN plasmidico. El segundo lavado es especialmente necesario cuando grandes volumenes de cultivo o de cepas materiales productoras de grandes cantidades de carbohidratos son usadas.
• Remover 400 o 240 microlitros de muestra de las fracciones combinadas de lavado y guardarlas para un gel analítico.
12) Eluir ADN con 5 o 15 ml de buffer QF.
Recolectar el eluido en un tubo de 10 o 30 ml, el uso de tubos de centrifuga de policarbonato no es recomendado porque este material no es resistente al alcohol usando en los pasos subsecuentes.
• Remover una muestra de 100 a 60 microlitros del eluido y conservar para un gel analítico.
• Si se desea detener el protocolo y continuar luego, guardar el eluido a 4 grados c.periodos de almacenado mas largos que una noche no son recomendados.
13) Precipitar el ADN aniadiendo 3,5 o 10,5 ml de isopropanol a temperatura ambiente al ADN eluido. Mezclar y centrifugar inmediatamente a 15000xg o mas por 30 minutos a 4 grados c. Decantar el sobrenadante cuidadosamente.
Todas las soluciones deberían estar a temperatura ambiente para minimizar el precipitado de sales, aunque la centrifugación se lleva a cabo a 4 grados c para prevenir el sobrecalentamineto d ela muestra. Una fuerza centrifuga de 15000xg corresponde a 9500 RPM en un Rotor Beckman JS-13 y a 11000 RPM en un Rotor Sorvall SS-34.de forma alternativa tubos con fondo conico desechables de centrifuga pueden ser usados para centrifugar a 5000xg por 60 minutos a 4 grados c. pellets de isopropanol tienen una apriencia vidriosa y pueden ser mas difíciles de ver que las esponjosas pellets que contienen salque resultan de la preccipitacion con etanol. Marcar el exterior del tubo antes de la centrifugación permite que el pellet se a mas fácil de localizar. Pellets de isopropanol se agarran mal a la pared del tubo, y se debería tener cuidado cuando se remueve el sobrenadante.
14) Lavar el pellet de ADN con 2 o 5 ml de etanol 70% a temperatura ambiente, y centrifugar a 15000xg o mas por 10 minutos. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet.
De forma alternativa tubos con fondo conico desechables de centrifuga pueden ser usados para centrifugar a 5000xg por 60 minutos a 4 grados c. el etanol 70% remueve la sal precipitada y reemplaza el isopropanol cn etanol que es mas volátil, haciendo que el ADN sea mas fácil de redisolver
15) Dejar secar el pellet al aire libre por 5-10 minutos, y redisolver en un volumen apropiado de buffer ( e.g., buffer TE, PH 8.0, o 10 mM de Tris.Cl, PH 8.5)
Redisolver el pellet de ADN enjuagando las paredes para recuperar todo el ADN, especialmente si se utilizaron tubos de vidrio. Pipeteear el ADN acia arriba y hacia abajo para promober la resuspencion podria causar erompimiento y deberia ser evitado. Dejar secar el pellet por muchoo tiempo hara que el ADN sea dificil de redisolver. El ADN se disuelve mejor bajo condiciones ligeramente alcalinas; no se disuelve facilmente en buffers acidos.
Nosotros realizamos la extracción de plásmidos recombinados con el gen de la IL-12
Y por último, la cara de felicidad de Ezequiel al usar propipetas con botoncitos sin andar apretando valvulas duras ni usar la boca (que esta muy mal por cierto)
